aav5的分离的修饰的vp1衣壳蛋白
发明领域
1.本技术涉及基因疗法和分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的分离的改变的vp1蛋白，与野生型aav5衣壳的vp1蛋白相比较，其包含改善转导效率的一种或多种氨基酸取代，以及涉及基于它的衣壳和载体。
2.发明背景腺相关病毒(aav)为一种小型(20 nm)独立复制缺陷型非包膜病毒。许多不同的aav血清型已在人类和灵长类动物中被描述。腺相关病毒基因组由约4,700个核苷酸长的(+或-)单链dna (ssdna)组成。基因组dna在末端具有末端反向重复(itr)。基因组包含两个开放阅读框(orf)，即rep和cap，其包含编码各种蛋白产物的几个可选阅读框。rep产物对aav复制至关重要，而3种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)以及其他替代产物由cap基因编码。vp1、vp2和vp3蛋白以1:1:10的比率形成二十面体衣壳(xie q.等人，the atomic structure of adeno-associated virus (aav-2), a vector for human gene therapy. proc natl acad sci usa, 2002; 99:10405-10410)。在重组aav (raav)载体产生期间，将侧接itr的表达盒包装到aav衣壳内。aav复制所需的基因不包含在盒中。重组aav被认为是用于体内基因转移的最安全和最广泛使用的病毒载体之一。载体可感染多种组织类型的细胞，以提供强大和持续的转基因表达。它们也是非致病性的，并且具有低免疫原性特征(high ka等人，”raav human trial experience” methods mol biol. 2011; 807:429-57)。
3.有效基因疗法开发领域的试验的基本目标之一为优化载体以最大化组织转导同时最小化载体剂量。
4.已知各种aav血清型的特征为对不同的宿主细胞表面受体的亲和力，它们对这些受体具有趋向性。因此，aav2的主要已知受体为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，共同受体为整联蛋白异二聚体avβ5、1型成纤维细胞生长因子受体和肝细胞生长因子受体c-met。aav12与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和唾液酸结合。aav4和aav5分别与n-和o-连接的唾液酸结合。aav5激活血小板衍生的生长因子受体。同时，在aav衣壳蛋白的氨基酸序列与其组装过程、基因组的衣壳化、对宿主细胞表面呈现的不同类型受体的亲和力之间已建立了结合(govindasamy l.等人，structural insights into adeno-associated virus serotype 5. j virol. 2013 oct;87(20): 11187-99)。
5.国际申请wo 2012145601公开了具有变体衣壳蛋白的腺相关病毒(aav)病毒体，其中与野生型aav相比较，当经玻璃体内注射给予时，该aav病毒体表现出对视网膜细胞更大的感染性。
6.国际申请wo 2013158879公开了向受试者递送异源核酸序列的腺相关病毒(aav)载体，其包含vp1衣壳蛋白，该蛋白包含一种或多种赖氨酸取代，其中一种赖氨酸取代为k137r，其中所述赖氨酸取代有效抑制所述衣壳蛋白的泛素化，从而增加所述aav载体在靶细胞中的转导。
7.当前需要具有改善的转导能力的aav，其在其结构中包括各种转基因，包括临床上重要的转基因，用于需要它的患者。改善的组织转导能够使给予受试者的载体剂量最小化。
8.发明人已意外地发现野生型aav5衣壳的vp1蛋白中存在一种或多种氨基酸取代，其选自：s651a，s2a和t711s或s2a、s651a和t711s，导致使用具有这种/这些修饰的aav血清5型载体转导靶细胞的效率提高和通过具有以上突变的raav载体的转基因递送效率显著提高。
9.发明简述在一方面，本发明涉及用于靶细胞的高度有效转导的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的分离的改变的vp1蛋白，其包含由cap基因编码的野生型aav5衣壳的vp1蛋白的氨基酸序列，和一种或多种选自以下的取代：s651a，s2a和t711s，s2a、s651a和t711s。
10.在一些实施方案中，野生型aav5衣壳的vp1蛋白的氨基酸序列具有由seq id no: 1表示的氨基酸序列。
11.在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白包括在s651a位置的一种取代。
12.在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白具有由seq id no: 2表示的氨基酸序列。
13.在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白包括s2a和t711s取代。
14.在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白具有由seq id no: 3表示的氨基酸序列。
15.在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白包括s2a、s651a和t711s取代。
16.在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白具有由seq id no: 4表示的氨基酸序列。
17.在一方面，本发明涉及编码以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸，其被用于靶细胞的高度有效转导。
18.在一些实施方案中，编码具有氨基酸s651a取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸由具有seq id no: 5的核酸序列或编码具有氨基酸s651a取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的蛋白的相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
19.在一些实施方案中，编码具有氨基酸s2a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸由具有seq id no: 6的核酸序列或编码具有氨基酸s2a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的蛋白的相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
20.在一些实施方案中，编码具有氨基酸s2a、s651a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸由具有seq id no: 7的核酸序列或编码具有
氨基酸s2a、s651a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的蛋白的相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
21.在一方面，本发明涉及用于靶细胞的高度有效转导的分离的衣壳，其包括以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白。
22.在一些实施方案中，分离的衣壳包括以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白、aav5衣壳的vp2蛋白或其改变的变体和aav5衣壳的vp3蛋白或其改变的变体。
23.在一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp2蛋白。
24.在一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp1蛋白，其具有由seq id no: 8表示的氨基酸序列。
25.在一些实施方案中，分离的衣壳包括腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp2蛋白。
26.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含t575s取代。
27.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含t575s取代，并且具有由seq id no: 9表示的氨基酸序列。
28.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含s515a和t575s取代。
29.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含s515a和t575s取代，并且具有由seq id no: 10表示的氨基酸序列。
30.在一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp3蛋白。
31.在一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp3蛋白，其具有由seq id no: 11表示的氨基酸序列。
32.在一些实施方案中，分离的衣壳包括腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp3蛋白。
33.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含t519s取代。
34.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含t519s取代，并且具有由seq id no: 12表示的氨基酸序列。
35.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含s459a和t519s取代。
36.在一些实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含s459a和t519s取代，并且具有由seq id no: 13表示的氨基酸序列。
37.在一方面，本发明涉及编码以上衣壳的分离的核酸，其被用于靶细胞的高度有效转导。
38.在一方面，本发明涉及用于向受试者递送异源核酸序列的基于重组腺相关病毒血清5型(raav5)的载体，其包括：1) 以上衣壳，和2) 异源核酸序列，其包含促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达的调控序列。
39.在一些实施方案中，基于raav5的载体包含异源核酸序列，该序列编码的产物为治疗性多肽或报告多肽。
40.在一些实施方案中，基于raav5的载体包含异源核酸序列，该序列编码的产物为治疗性多肽，其中治疗性多肽为选自因子viii、因子ix或其功能变体的凝血因子。
41.在一些实施方案中，基于raav5的载体包含异源核酸序列，该序列编码的产物为因子viii或其功能变体。
42.在一些实施方案中，基于raav5的载体包含异源核酸序列，该序列编码的产物为因子ix或其功能变体。
43.在一方面，本发明涉及用于向需要它的受试者递送基因产物的药用组合物，其包含：a) 以上基于raav5的载体；和b) 药学上可接受的赋形剂。
44.在一些实施方案中，使用药用组合物用于向需要它的人类递送基因产物。
45.在一方面，本发明涉及用于向需要它的受试者递送基因产物的方法，其包括给予受试者以上基于raav5的载体或以上药用组合物。
46.在一些实施方案中，用于递送基因产物的方法被用于向需要它的人类递送基因产物。
47.在一方面，本发明涉及以上基于raav5的载体或以上药用组合物用于在需要它的受试者中治疗疾病的用途。
48.在一些实施方案中，用途为用于在需要它的人类中治疗疾病。
49.在用途的一些实施方案中，疾病选自血液疾病、中枢神经系统疾病、代谢性疾病、肌肉疾病、遗传性疾病。
50.在用途的一些实施方案中，疾病为血液疾病。
51.在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物为因子ix或其功能变体。
52.在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物为因子viii或其功能变体。
53.在用途的一些实施方案中，疾病为肌肉疾病。
54.在用途的一些实施方案中，疾病为遗传性疾病。
55.在一方面，本发明涉及用于产生以上基于raav5的载体的方法，其包括用以上编码以上衣壳的核酸转染生产细胞。
56.附图简述图1. 预期用于克隆aav血清5型衣壳基因的随机变体文库的质粒paav-接头的环形方案。
57.ampr为提供对于氨苄西林的抗性的β-内酰胺酶基因，puc起点为细菌中的puc复制起点，itr为反向末端重复，cmv-启动子为巨细胞病毒早期基因的启动子，多聚a为多聚腺苷酸化信号序列，用于增加mrna稳定性，hbg内含子为人类β珠蛋白内含子，gfp为绿色荧光蛋白基因，
t2a为允许靶蛋白和报告蛋白共表达的2a自切割肽。
58.图2. 预期用于从随机变体文库产生野生型aav血清5型的重组病毒产物的质粒paav-rep的环形方案。
59.ampr为提供对于氨苄西林的抗性的β-内酰胺酶基因，puc起点为细菌中的puc复制起点，rep基因为编码aav复制蛋白的rep基因序列。
60.图3. 预期用于从随机变体文库产生野生型aav血清5型的重组病毒产物的质粒phelper的环形方案。
61.ampr为提供对于氨苄西林的抗性的β-内酰胺酶基因，ori为细菌中的复制起点，adeno e2a为参与病毒dna复制的辅助腺病毒基因序列，adeno e4为参与病毒dna复制的辅助腺病毒基因序列，adeno varna为负责翻译早期和晚期病毒基因两者的辅助腺病毒基因序列。
62.图4. 用基于aav5-gfp的病毒产物进行的cho-k1-s细胞转导的效率分析，其中野生型aav5衣壳的vp1蛋白包括一种或多种氨基酸取代。
63.图5. 用基于aav5-hfix的病毒产物转导后7天分析收获自cho-k1-s细胞的培养基中的hfix蛋白浓度，其中野生型aav5衣壳的vp1蛋白包括一种或多种氨基酸取代。
64.图6. aav5衣壳蛋白在基因组中的位置。
65.2087-4258 bp
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vp12495-4258 bp
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vp22663-4258 bp
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vp3发明描述定义与一般方法除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
66.进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，以及复数术语应包括单数。一般地，本文描述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学以及蛋白质和核酸的杂交和化学的分类和方法为本领域技术人员众所周知和广泛使用的。酶反应和纯化方法根据制造商的指南，如本领域中常见的或者如本文所述进行。
[0067]“分离的”意指从天然状态改变或移出。例如，动物体内天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽则为“分离的”。分离的核酸或蛋白可以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境(比如遗传修饰的细胞)中。
[0068]
术语“天然存在的”、“天然的”或“野生型”用于描述可在自然界中发现的不同于人工产生的物体。例如，存在于生物体(包括病毒)中的蛋白或核苷酸序列，其可从自然界中的来源分离出来并且未经实验室人员有意修饰，为天然存在的。
[0069]
术语“基因组”是指生物体的完整遗传物质。
[0070]
如在本说明书和随后的权利要求中使用的，除非上下文另外规定，否则词语“包括
(include)”和“包含(comprise)”或其变体比如“具有”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意指包括所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
[0071]
蛋白(肽)如在本说明书中使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且它们是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白。如在本说明书中使用的，该术语是指在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体的短链，和在本领域中通常被称为蛋白(其中有很多类型)的较长链两者。“多肽”尤其包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0072]
术语“转化”、“转染”和“转导”是指通过其将核酸引入到细胞或宿主生物体中的任何方法或手段，并且可互换使用以表达相同含义。这类方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、感染、peg-融合等。
[0073]
核酸分子在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”意指核苷酸的精确序列，无论修饰与否，确定核酸的片段还是区域，无论是否含有非天然核苷酸，以及为双链dna或rna、单链dna或rna还是为所述dna的转录产物。
[0074]
本领域的技术人员具有一般知识，即核酸为可水解成单体“核苷酸”的多核苷酸。单体核苷酸可被水解成核苷。如在本说明书中使用的，多核苷酸包括(作为非限制性实例)通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，所述手段包括(作为非限制性实例)重组手段，即从重组文库或细胞基因组使用普通克隆技术和pcr等克隆核酸序列，和合成手段。
[0075]
在此还应当注意的是，本发明不涉及处于其天然染色体环境中，即处于天然状态的核苷酸序列。本发明的序列已被分离和/或纯化，即它们被直接或间接取样，例如通过拷贝，它们的环境已被至少部分地改变。因此，在此还应提及通过重组遗传学(例如通过宿主细胞)获得或通过化学合成获得的分离的核酸。
[0076]“分离的”核酸分子为从至少一种核酸分子-杂质中鉴定和分离的核酸分子，其一般在核酸酶核酸的天然来源中与核酸分子-杂质结合。分离的核酸分子不同于在天然条件下发现其的形式或集合。因此，分离的核酸分子不同于在天然条件下存在于细胞中的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括位于核酸酶在其中正常表达的细胞中的核酸分子，例如，如果核酸分子具有不同于其在天然条件下于细胞中的定位的染色体定位。
[0077]
除非另外指明，否则术语核苷酸序列包括其互补序列。因此，具有特定序列的核酸应被理解为包括含其互补序列的其互补链的核酸。
[0078]
腺相关病毒(aav)细小病毒科病毒为小型含有dna的动物病毒。细小病毒科可被分为两个亚科：其成员感染脊椎动物的细小病毒亚科(parvovirinae)和其成员感染昆虫的浓病毒亚科(densovirinae)。至2006年，已经描述了腺相关病毒的11种血清型(mori, s.等人，2004, “
two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein”, virology, т. 330 (2): 375-83)。所有已知的血清型均可感染来自多种组织类型的细胞。组织特异性由衣壳蛋白血清型决定；因此，基于腺相关病毒的载体通过指定期望的血清型来构建。文献中描述了关于细小病毒和细小病毒科其他成员的进一步信息(kenneth i. berns, “parvoviridae: the viruses and their replication”, fields virology中第69章(1996年第3版))。
[0079]
所有已知aav血清型的基因组组织非常相似。aav的基因组为长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链dna分子。反向末端重复(itr)在非结构蛋白(rep)和结构蛋白(cap)复制的独特编码核苷酸序列的侧翼。cap基因编码形成衣壳的vp蛋白(vp1、vp2和vp3)。末端145个核苷酸为自我互补的，并且被组织成使得形成t形发夹的能量稳定的分子内双链体可以形成。这类发夹结构充当病毒dna复制的起点，用作细胞dna聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中感染野生型aav (wtaav)后，rep基因(如rep78和rep52)分别使用p5启动子和p19启动子进行表达，并且两种rep蛋白在病毒基因组的复制中都具有一定功能。rep开放阅读框(rep orf)中的剪接事件导致实际上4种rep蛋白(例如rep78、rep68、rep52和rep40)的表达。然而，已经表明编码rep78和rep52蛋白的未剪接mrna足以在哺乳动物细胞中产生aav载体。
[0080]
基于重组腺相关病毒(raav)的载体如本文使用的，术语“载体”意指能够转运其已连接的另一种核酸的核酸分子。
[0081]
如本说明书中使用的，术语“重组aav载体”(或“raav载体”)是指包含侧接细小病毒或反向末端重复序列(itr)的一个或多个感兴趣的多核苷酸序列、感兴趣的基因或“转基因”的载体。
[0082]
如关于病毒滴度使用的，术语“感染单位(iu)”、“感染性粒子”或“复制单位”是指如通过感染中心测定(也被称为复制中心测定，如例如在mclaughlin等人，j. virol. (1988) 62:1963-1973中所述)测量的感染性重组aav载体粒子的数量。
[0083]
当术语“异源”涉及核酸序列比如编码序列和调控序列时，其表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域为在另一个核酸分子内或连接于另一个核酸分子的核酸片段，该片段未发现在自然界中与另一个分子相关联。例如，核酸构建体的异源区域可包括编码序列，其侧接未发现在自然界中与编码序列相关联的序列。异源编码序列的另一个实例为其中编码序列本身在自然界中未被发现的构建体(例如具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。
[0084]
如本文使用的术语“可操作地连接的”是指多核苷酸(或多肽)元件在功能关系中的连接。当核酸与另一个核酸序列以功能关系条件存在时，所述核酸为“可操作地连接的”。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则其为与所述编码序列可操作地连接的。术语“可操作地连接的”意指所连接的dna序列一般为连续的，并且在需要连接两个蛋白编码区的情况下也为连续的并且存在于阅读框中。
[0085]
如在本说明书中使用的，术语“启动子”或“转录调控序列”或“调控序列”是指控制一种或多种编码序列的转录的核酸片段，并且其位于读取方向(相对于从编码序列的转录起始位点的转录方向)的上游，并且在结构上通过dna依赖性rna聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他dna序列的存在来识别，所述其他dna序列包括但不限于转录因子结合位
点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接调控用所述启动子转录的水平的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子为在典型生理和发育条件下于大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子为生理上或发育上，例如在化学诱导剂的影响下受调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。
[0086]
如本文使用的，术语“增强子(enhancers)”或“增强子(enhancer)”可指位于编码重组产物的dna序列相邻处的dna序列。增强子元件一般位于启动子元件的5’方向或者可位于编码dna序列(例如转录或翻译成一种或多种重组产物的dna序列)的下游或内部。因此，增强子元件可位于编码重组产物的dna序列上游或所述序列下游100个碱基对、200个碱基对或者300或更多个碱基对处。增强子元件可增加从dna序列表达的重组产物的量达高于与单个启动子元件相关的表达水平。本领域的普通技术人员可容易地获得多种增强剂元件。
[0087]
术语“选择标记基因”是指当表达时赋予转化细胞可选择表型(例如抗生素抗性)的基因。
[0088]
如在本说明书中使用的，术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0089]
治疗用途“基因疗法”为将基因插入到受试者的细胞和/或组织中以治疗疾病，一般为遗传性疾病，其中缺陷型突变等位基因被功能性等位基因替换。
[0090]“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“疗法”是指缓解或消除生物障碍和/或至少一种其伴随症状的方法。如本文使用的，“缓解”疾病、障碍或病症意指降低疾病、障碍或病症的症状的严重性和/或发生频率。进一步地，本文指涉的“治疗”包括指涉治愈性、姑息性和预防性治疗。
[0091]
在一方面，治疗的受试者或患者为哺乳动物，优选地为人类受试者。所述受试者可为任何年龄的雄性或雌性。
[0092]
术语“障碍”意指将受益于根据本发明的治疗的任何病症。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患讨论中的障碍的那些病理状况。
[0093]“疾病”为动物的健康状态，其中动物无法维持体内稳态并且其中如果疾病没有得到改善，那么动物的健康状况就会继续恶化。
[0094]
术语“受试者”、“患者”、“个体”等在本说明书中可互换使用，并且它们是指适用于本说明书中描述的方法的任何动物。在某些非限制性实施方案中，受试者、患者或个体为人类。
[0095]“治疗有效量”是指在治疗期间给予的将在一定程度上缓解所治疗疾病的一种或多种症状的治疗剂的量。
[0096]
术语“慢性”使用是指持续(不间断)使用药物，而不是急性(短暂)给予途径，以便在长时间段内维持初始治疗效果(活性)。
[0097]“间歇性”使用是指并非不间断地持续进行，而是在本质上为相当周期性的治疗。
[0098]
发明详述腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的分离的改变的vp1蛋白在一方面，本发明涉及用于靶细胞的高度有效转导的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的分离的改变的vp1蛋白，其包含由cap基因编码的野生型aav5衣壳的vp1蛋白的氨基
酸序列，和一种或多种选自以下的取代：s651a，s2a和t711s，s2a、s651a和t711s。
[0099]
氨基酸s2a取代被理解为意指野生型腺相关病毒血清5型衣壳的vp1蛋白2位置的丝氨酸(ser，s)被丙氨酸(ala，a)取代。
[0100]
氨基酸s651a取代被理解为意指野生型腺相关病毒血清5型衣壳的vp1蛋白651位置的丝氨酸(ser，s)被丙氨酸(ala，a)取代。
[0101]
氨基酸t711s取代被理解为意指野生型腺相关病毒血清5型衣壳的vp1蛋白711位置的苏氨酸(thr，t)被丝氨酸(ser，s)取代。
[0102]
在一些实施方案中，野生型aav5衣壳的vp1蛋白的氨基酸序列具有由以下表示的氨基酸序列：msfvdhppdwleevgeglreflgleagppkpkpnqqhqdqarglvlpgynylgpgngldrgepvnradevarehdisyneqleagdnpylkynhadaefqekladdtsfggnlgkavfqakkrvlepfglveegaktaptgkriddhfpkrkkarteedskpstssdaeagpsgsqqlqipaqpasslgadtmsaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfsdvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrttrpigtryltrpl (seq id no: 1)。
[0103]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白包括在s651a位置的一种取代。
[0104]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：msfvdhppdwleevgeglreflgleagppkpkpnqqhqdqarglvlpgynylgpgngldrgepvnradevarehdisyneqleagdnpylkynhadaefqekladdtsfggnlgkavfqakkrvlepfglveegaktaptgkriddhfpkrkkarteedskpstssdaeagpsgsqqlqipaqpasslgadtmsaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfadvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrttrpigtryltrpl (seq id no: 2)。
[0105]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白包括s2a和t711s取代。
[0106]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：mafvdhppdwleevgeglreflgleagppkpkpnqqhqdqarglvlpgynylgpgngldrgepvnradevarehdisyneqleagdnpylkynhadaefqekladdtsfggnlgkavfqakkrvlepfglveegaktaptgkriddh
fpkrkkarteedskpstssdaeagpsgsqqlqipaqpasslgadtmsaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfsdvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrstrpigtryltrpl (seq id no: 3)。
[0107]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白包括s2a、s651a和t711s取代。
[0108]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp1蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：mafvdhppdwleevgeglreflgleagppkpkpnqqhqdqarglvlpgynylgpgngldrgepvnradevarehdisyneqleagdnpylkynhadaefqekladdtsfggnlgkavfqakkrvlepfglveegaktaptgkriddhfpkrkkarteedskpstssdaeagpsgsqqlqipaqpasslgadtmsaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfadvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrstrpigtryltrpl (seq id no: 4)。
[0109]
腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的分离的改变的vp2和vp3蛋白腺相关病毒的基因组dna (+)-链的“右侧”包含编码3种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)的重叠序列。这些基因的转录从一个启动子p40开始。相应蛋白的分子量分别为87、72和62 kda。所有这3种蛋白均为从单个mrna翻译而来。转录之后，mrna前体可以两种不同的方式进行剪接，其中较长或较短的内含子被切除以形成2300或2600个核苷酸长的mrna。
[0110]
因此，将突变引入到cas基因内不仅会影响aav5衣壳的vp1蛋白，还会影响aav5衣壳的vp2和vp3蛋白。
[0111]
图6为aav5衣壳蛋白在aav基因组中的位置示意图：2087-4258 bp
ꢀ‑ꢀ
vp12495-4258 bp
ꢀ‑ꢀ
vp22663-4258 bp
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vp3。
[0112]
综上所述，vp2和vp3中将不存在与vp1中的突变s2a相似的突变，而与vp1中的突变s651a和/或t711s相似的突变将存在于vp2和vp3两者中。
[0113]
考虑到编码3种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)的重叠序列，vp1中的氨基酸取代s651a将对应于：vp2中s515a位置的氨基酸取代；vp3中s459a位置的氨基酸取代。
[0114]
考虑到编码3种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)的重叠序列，氨基酸t711s取代将对应
于：vp2中t575s位置的氨基酸取代；vp3中t519s位置的氨基酸取代。
[0115]
进一步地，申请人认为通过指明包括vp1/vp2/vp3中的所述突变的短氨基酸序列来具体说明已发现突变的环境为合适的：对于vp1中的s2a (vp2和vp3中不存在)
ꢀ‑ꢀ
msfvdhp；对于vp1中的s651a (vp2中的s515a/vp3中的s459a)
ꢀ‑ꢀ
tsfsdvp；对于vp1中的t711s (vp2中的t575s/vp3中的t519s)
ꢀ‑ꢀ
eyrttrp。
[0116]
在一些实施方案中，野生型aav5衣壳的vp2蛋白的氨基酸序列具有由以下表示的氨基酸序列：taptgkriddhfpkrkkarteedskpstssdaeagpsgsqqlqipaqpasslgadtmsaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfsdvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrttrpigtryltrpl (seq id no: 8)。
[0117]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp2蛋白包括t575s取代。
[0118]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp2蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：taptgkriddhfpkrkkarteedskpstssdaeagpsgsqqlqipaqpasslgadtmsaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfsdvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrstrpigtryltrpl (seq id no: 9)。
[0119]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp2蛋白包括s515a和t575s取代。
[0120]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp2蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：taptgkriddhfpkrkkarteedskpstssdaeagpsgsqqlqipaqpasslgadtmsaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfadvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrstrpigtryltrpl (seq id no: 10)。
[0121]
在一些实施方案中，野生型aav5衣壳的vp3蛋白的氨基酸序列具有由以下表示的氨基酸序列：msaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfsdvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrttrpigtryltrpl (seq id no: 11)。
[0122]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp3蛋白包括t519s取代。
[0123]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp3蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：msaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfsdvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrstrpigtryltrpl (seq id no: 12)。
[0124]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp3蛋白包括s459a和t519s取代。
[0125]
在一些实施方案中，aav5衣壳的分离的改变的vp3蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：msaggggplgdnnqgadgvgnasgdwhcdstwmgdrvvtkstrtwvlpsynnhqyreiksgsvdgsnanayfgystpwgyfdfnrfhshwsprdwqrlinnywgfrprslrvkifniqvkevtvqdstttiannltstvqvftdddyqlpyvvgngtegclpafppqvftlpqygyatlnrdntenpterssffcleyfpskmlrtgnnfeftynfeevpfhssfapsqnlfklanplvdqylyrfvstnntggvqfnknlagryantyknwfpgpmgrtqgwnlgsgvnrasvsafattnrmelegasyqvppqpngmtnnlqgsntyalentmifnsqpanpgttatylegnmlitsesetqpvnrvaynvggqmatnnqssttapatgtynlqeivpgsvwmerdvylqgpiwakipetgahfhpspamggfglkhpppmmlikntpvpgnitsfadvpvssfitqystgqvtvemewelkkenskrwnpeiqytnnyndpqfvdfapdstgeyrstrpigtryltrpl (seq id no: 13)。
[0126]
衣壳在一方面，本发明涉及用于靶细胞的高度有效转导的分离的衣壳，其包括以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白。
[0127]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白、aav5衣壳的vp2蛋白或其改变的变体和aav5衣壳的vp3蛋白或其改变的变体。
[0128]
特别优选的实施方案包括本质上保守的取代，即发生在以其侧链加入的氨基酸家族内的取代。具体地讲，氨基酸一般被分为4个家族：(1) 酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸；(2) 碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3) 非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4) 非荷电极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类
为芳香族氨基酸。例如，可合理地预测，单独将亮氨酸取代为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸取代为谷氨酸、将苏氨酸取代为丝氨酸或将氨基酸类似地保守取代为结构上相关的氨基酸，将不会对生物活性具有重大影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或者甚至多达约15-25或50个保守或非保守氨基酸取代，或者5-50之间的任何整数，只要期望的分子功能保持完整。
[0129]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp2蛋白。
[0130]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp2蛋白，其具有由seq id no: 8表示的氨基酸序列。
[0131]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp2蛋白。
[0132]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含t575s取代。
[0133]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含t575s取代，并且具有由seq id no: 9表示的氨基酸序列。
[0134]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含s515a和t575s取代。
[0135]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp2蛋白，其包含s515a和t575s取代，并且具有由seq id no: 10表示的氨基酸序列。
[0136]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp3蛋白。
[0137]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括野生型aav5衣壳的vp3蛋白，其具有由seq id no: 11表示的氨基酸序列。
[0138]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp3蛋白。
[0139]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含t519s取代。
[0140]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含t519s取代，并且具有由seq id no: 12表示的氨基酸序列。
[0141]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含s459a和t519s取代。
[0142]
在一个实施方案中，分离的衣壳包括aav5衣壳的改变的vp3蛋白，其包含s459a和t519s取代，并且具有由seq id no: 13表示的氨基酸序列。
[0143]
分离的核酸在一方面，本发明涉及编码以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸，其被用于靶细胞的高度有效转导。
[0144]
在一些实施方案中，编码具有氨基酸s651a取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸由核酸序列atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctac
ctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctgttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttcgcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa (seq id no: 5)或由编码具有氨基酸s651a取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的蛋白的相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
[0145]“编码具有氨基酸s651a取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 5的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 2公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0146]
在一些实施方案中，编码具有氨基酸s2a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸由核酸序列atggcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaaga
cggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa (seq id no: 6)或由编码具有氨基酸s2a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
[0147]“编码具有氨基酸s2a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 6的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 3公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0148]
在一些实施方案中，编码具有氨基酸s2a、s651a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的分离的核酸由核酸序列atggcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaa
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[0149]“编码具有氨基酸s2a、s651a和t711s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 7的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 4公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这种变体dna序列处于本发明的范围内。
[0150]
编码以上野生型腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的vp1的分离的核酸由核酸序列atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggct
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[0151]“编码野生型腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的vp1蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 14的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 1公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这种变体dna序列处于本发明的范围内。
[0152]
在一方面，本发明涉及编码以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp2蛋白的分离的核酸。
[0153]
在一些实施方案中，编码具有氨基酸t575s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp2蛋白的分离的核酸由核酸序列acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttg
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[0154]“编码具有氨基酸t575s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp2蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 15的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 9公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0155]
在一些实施方案中，编码具有氨基酸s515a和t575s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp2蛋白的分离的核酸具有编码本文如seq id no: 10公开的氨基酸序列的任何核酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0156]
编码以上野生型腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的vp2的分离的核酸由核酸序列acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccac
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[0157]“编码野生型腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的vp2蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 16的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 8公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0158]
在一方面，本发明涉及编码以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp3蛋白的分离的核酸。
[0159]
在一些实施方案中，编码具有氨基酸t519s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp3蛋白的分离的核酸由核酸序列atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagaga
tccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa (seq id no: 17)或由编码具有氨基酸t519s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp3蛋白的相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
[0160]“编码具有氨基酸t519s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp3蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 17的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 12公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0161]
在一些实施方案中，编码具有氨基酸s459a和t519s取代的腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp3蛋白的分离的核酸具有编码本文如seq id no: 13公开的氨基酸序列的任何核酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0162]
编码以上野生型腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的vp3的分离的核酸由核酸序列atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa (seq id no: 18)或由编码野生型腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的vp3蛋白的相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
[0163]“编码野生型腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的vp3蛋白的相应氨基酸序列的其他序列”意指可替代具有seq id no: 18的核酸序列的核酸序列，因为由于遗传密码的简并
性，广泛范围的不同dna序列可编码本文如seq id no: 11公开的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代dna序列完全处于本领域技术人员的技能范围内。这类变体dna序列处于本发明的范围内。
[0164]
在一方面，本发明涉及编码以上衣壳的分离的核酸，其被用于靶细胞的高度有效转导。
[0165]
在一些实施方案中，编码以上衣壳的分离的核酸包括任何以上核酸序列。
[0166]
基于重组腺相关病毒血清5型(raav5)的载体在一方面，本发明涉及用于向受试者递送异源核酸序列的基于重组腺相关病毒血清5型(raav5)的载体，其包括：1) 以上衣壳，和2) 异源核酸序列，其包含促进由异源核酸序列编码的目标产物在靶细胞中的表达的调控序列。
[0167]
本发明的raav载体不包含编码非结构蛋白(rep)和结构蛋白(cap)的基因的核苷酸序列。
[0168]
在本说明书的以上部分中详细表征了衣壳。
[0169]
在一些实施方案中，基于raav5的载体具有异源核酸序列的表达产物，其为治疗性多肽或报告多肽。
[0170]
在一些实施方案中，基于raav5的载体包含异源核酸序列，该序列编码的产物为治疗性多肽，其中治疗性多肽为选自因子viii、因子ix或其功能变体的凝血因子。
[0171]
在一些实施方案中，基于raav5的载体包含异源核酸序列，该序列编码的产物为因子viii或其功能变体。
[0172]
在一些实施方案中，基于raav5的载体包含异源核酸序列，该序列编码的产物为因子ix或其功能变体。
[0173]
药用组合物在一方面，本发明涉及用于向需要它的受试者递送基因产物的药用组合物，其包含：a) 以上基于raav5的载体；和b) 药学上可接受的赋形剂。
[0174]
在一些实施方案中，药用组合物被用于向需要它的人类递送基因产物。
[0175]
在特定实施方案中，本发明涉及包含在药学上可接受的载剂或其他医用物质、药用物质、载剂、佐剂、稀释剂等中的本发明raav5病毒粒子的药用组合物。对于注射，载剂一般为液体载剂。对于其他给予方法，载剂可为固体或液体，比如无菌无热原水或无菌无热原磷酸盐缓冲盐水溶液。对于吸入给予，载剂为可吸入的，并且优选地呈固体或液体颗粒形式。作为注射介质，优选的是使用含有注射溶液剂常用的添加剂(比如稳定剂、盐或盐水和/或缓冲剂)的水。
[0176]
在其他实施方案中，本发明涉及包含在药学上可接受的载剂或其他医用物质、药用物质、载剂、佐剂、稀释剂等中的细胞的药用组合物，其中基于raav5的载体被整合到所述细胞的基因组中。
[0177]“药用组合物”意指包含以上本发明基于raav5的载体和至少一种选自药学上可接
受的和药理学相容的赋形剂的组分的组合物，所述赋形剂比如填充剂、溶剂、稀释剂、载剂、助剂、分布剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂、延长递送控制剂，其选择和比例取决于给予的类型和途径以及剂量。本发明的药用组合物及其制备方法对于本领域技术人员无疑会是显而易见的。药用组合物应优选地按照gmp (良好生产规范)要求制造。组合物可包含缓冲组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。
[0178]“药学上可接受的”意指不具有生物学或其他负面副作用的材料，例如，可将该材料给予受试者而不会引起任何不期望的生物学效应。因此，这类药用组合物可被用于例如离体转染细胞或将病毒粒子或细胞在体内直接给予受试者。
[0179]
术语“赋形剂”在本文中被用于描述除以上本发明成分以外的任何成分。这些为具有无机或有机性质的物质，其被用于制药以使药品具有必要的物理化学特性。
[0180]“稳定剂”是指提供活性剂的物理和/或化学稳定性的赋形剂或者两种或更多种赋形剂的混合物。
[0181]
术语“缓冲液”、“缓冲液组合物”、“缓冲剂”是指能够通过其酸碱共轭组分的作用来抵抗ph变化的溶液，这允许基于raav5产物的载体抵抗ph的变化。通常，药用组合物优选地具有4.0-8.0范围内的ph。可使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。
[0182]
如果活性剂在例如2-8℃的储存温度下于指定的保质期期间保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，则药用组合物为“稳定的”。优选地，活性剂保持物理和化学稳定性两者，以及生物活性。储存期基于加速或自然老化条件下的稳定性测试结果进行调整。
[0183]
本发明的药用组合物可呈现成制剂形式以单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式进行制造、包装或广泛销售。如本文使用的，术语“单一单位剂量”是指含有预定量的活性成分的离散量的药用组合物。活性成分的量一般等于待在受试者体内给予的活性成分的剂量，或此剂量的便利部分，例如此剂量的一半或三分之一。
[0184]
用于基因产物递送的方法在一方面，本发明涉及用于向需要它的受试者递送基因产物的方法，其包括给予受试者以上基于raav5的载体或以上药用组合物。
[0185]
在一些实施方案中，用于递送基因产物的方法被用于向需要它的人类递送基因产物。
[0186]
本领域公认的用于给予基于raav5的载体的任何方法均可适合用于以上本发明基于raav5的载体。
[0187]
基于raav5的重组病毒载体优选以生物有效量给予细胞。病毒载体的“生物有效”量为足以引起细胞中异源核酸序列的感染(或转导)和表达的量。如果将病毒在体内给予细胞(例如如下所述将病毒给予受试者)，则病毒载体的“生物有效”量为足以引起靶细胞中异源核酸序列的转导和表达的量。
[0188]
用于给予本发明raav5病毒载体的细胞可为任何类型的细胞，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞)、肺细胞、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细
胞等。或者，用于给予raav5病毒载体的细胞可为任何祖细胞。作为进一步的备选，该细胞可为干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。此外，如上所述，该细胞可来自任何来源的物种。
[0189]
用途在一方面，本发明涉及以上基于raav5的载体或以上药用组合物用于在需要它的受试者中治疗疾病的用途。
[0190]
在一些实施方案中，用途为用于在需要它的人类中治疗疾病。
[0191]
将本发明基于raav5的载体给予需要它的人类受试者或动物可通过本领域已知的用于给予病毒载体的任何手段进行。
[0192]
示例性的给予方式包括局部、口服、直肠、经粘膜、经皮、吸入、肠胃外给予(例如静脉内、皮下、皮内、肌内和关节内给予)等，以及直接组织或器官注射，以及备选地，鞘内、直接肌内、心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。注射剂可以常规形式进行制备，作为液体溶液剂或混悬剂，适合于在注射之前于液体中制备溶液剂或混悬剂的固体形式，或者作为乳剂。或者，可以局部而非全身方式给予基于raav5的载体，例如以贮库或缓释制剂。
[0193]
在用途的一些实施方案中，疾病选自血液疾病、中枢神经系统疾病、代谢性疾病、肌肉疾病、遗传性疾病。
[0194]
在用途的一些实施方案中，疾病为血液疾病。
[0195]
在用途的一些实施方案中，疾病为肌肉疾病。
[0196]
在用途的一些实施方案中，疾病为遗传性疾病。
[0197]
在本发明的特定实施方案中，感兴趣的核苷酸序列通过基于raav5的载体递送至受试者的肝脏。可通过本领域已知的任何方法进行肝脏给予，所述方法包括但不限于静脉内给予、门静脉内给予、胆内给予、动脉内给予和直接注射到肝实质中。
[0198]
优选地，细胞(例如肝细胞)被编码肽或蛋白的基于raav5的载体感染，该细胞表达编码的肽或蛋白并将其以治疗有效量(如下所述)分泌到血液循环系统内。或者，载体被递送至另一细胞或组织并由其表达，所述另一细胞或组织包括但不限于脑、胰腺、脾脏或肌肉。
[0199]“治疗有效量”被理解为意指足以缓解(例如减轻、降低、减少)与疾病状态相关的至少一种症状的量。或者说，“治疗有效”量为足以在受试者的病症中提供一些改善的量。
[0200]
在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物为因子ix或其功能变体。
[0201]
在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物为因子viii或其功能变体。
[0202]
在其他优选的实施方案中，肌内给予本发明基于raav5的载体，更优选地通过肌内注射或通过局部给予(如上所述)。在其他优选的实施方案中，将本发明的细小病毒粒子给予肺部。
[0203]
本发明中公开的基于raav5的载体可通过任何合适的手段给予受试者的肺部，但优选地以受试者将其吸入的包含本发明基于raav5的载体的可吸入粒子的气溶胶混悬剂的形式给予。可吸入粒子可为液体或固体。包含本发明的细小病毒raav5载体的液体粒子的气溶胶可通过任何合适的手段产生，比如用如本领域技术人员已知的压力驱动气溶胶喷雾器或超声喷雾器。包含本发明的病毒raav5载体的固体粒子的气溶胶也可通过制药领域已知的技术用任何固体颗粒药物气溶胶发生器来产生。
[0204]
本发明细小病毒raav5粒子的剂量将取决于给予方式、待治疗的疾病或病症、受试
者的病症、特定病毒载体和待递送的基因，并且可以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量为至少约105、106、107、108、109、10
、10
、10
、10
、10
、10
、10
或更多个转导单位，优选地为约10
8-10
个转导单位，仍然更优选地为10
个转导单位的病毒滴度。
[0205]
因此，可使用本发明的基于raav5的细小病毒载体、试剂和方法，以将核酸引导至分裂或非分裂细胞和在其中稳定表达异源核酸。使用该载体系统，现可在体内条件下将编码影响细胞生理学的蛋白的基因引入到细胞内。因此，本发明的载体可用于疾病状态的基因疗法。
[0206]
通常，可采用本发明来递送具有生物学效应的任何外源核酸，以治疗或改善与任何与基因表达相关的障碍相关的症状。示例性的疾病状态包括但不限于囊性纤维化(和其他肺部疾病)、血友病a、血友病b、地中海贫血、贫血和其他凝血障碍、艾滋病、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、癫痫和其他神经系统障碍、糖尿病、肌营养不良(例如duchenne、becker)、高雪氏病、胡尔勒氏病、腺苷脱氨酶缺乏症、糖原贮积病和其他代谢缺陷、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)的疾病等。
[0207]
基因转移在理解和提供用于疾病状态的疗法方面具有巨大的潜在用途。许多遗传性疾病的缺陷型基因是已知的并且已被克隆。在一些情况下，这些克隆基因的功能为已知的。通常，以上疾病状态分为两类：缺乏状态，一般为酶缺乏，其通常以隐性方式遗传；和不平衡状态，有时至少涉及调控或结构蛋白，其以显性方式遗传。对于缺乏状态的疾病，可使用基因转移将正常基因带入受影响的组织中用于替代疗法。对于不平衡疾病状态，可使用基因转移在模型系统中创建疾病状态，然后可努力用其对抗疾病状态。因此，本发明的方法允许治疗遗传性疾病。根据本发明，疾病状态通过部分或完全补救导致疾病或使其更严重的缺乏或不平衡来进行治疗。使用核酸序列的位点特异性整合来诱导突变或纠正缺乏也是可能的。
[0208]
用于产生基于raav5的载体的方法在一方面，本发明涉及用于产生以上基于raav5的载体的方法，其包括用以上包含编码衣壳的序列的核酸转染生产细胞，所述衣壳包括腺相关病毒血清5型(aav5)的改变的vp1衣壳蛋白。
[0209]
在用于产生基于raav5的载体的方法的一些实施方案中，使用以上核酸，其包含编码以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白、aav5衣壳的vp2蛋白或其改变的变体和aav5衣壳的vp3蛋白或其改变的变体的序列。
[0210]
野生型aav5衣壳的vp2蛋白和aav5衣壳蛋白的vp3蛋白的改变的变体被理解为意指包括一种或多种氨基酸取代的野生型aav5衣壳的vp2蛋白和野生型aav5衣壳的vp3蛋白的变体。
[0211]
特别优选的实施方案包括本质上保守的取代，即发生在以其侧链加入的氨基酸家族内的取代。具体地讲，氨基酸一般被分为4个家族：(1) 酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸；(2) 碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3) 非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4) 非荷电极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。例如，可合理地预测，单独将亮氨酸取代为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸取代为谷氨酸、将苏氨酸取代为丝氨酸或将氨基酸类似地保守取代为结构上相关的氨基
酸，将不会对生物活性具有重大影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或者甚至多达约15-25或50个保守或非保守氨基酸取代，或者5-50之间的任何整数，只要期望的分子功能保持完整。
[0212]
在用于产生基于raav5的载体的方法的一些实施方案中，使用以上核酸，其包含编码以上腺相关病毒血清5型(aav5)衣壳的改变的vp1蛋白、野生型aav5衣壳的vp2蛋白和野生型aav5衣壳的vp3蛋白的序列。
[0213]
aav5衣壳的vp2和vp3蛋白的改变的变体以及编码它们的核酸在本说明书的相应部分中详细公开。
实施例
[0214]
提供以下实施例以更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
[0215]
本说明书中引用的所有公开、专利和专利申请均通过参考结合至本文中。尽管为了清楚理解的目的，已通过说明和实例对前述发明进行了相当详细描述，但根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员将为显而易见的是可在不背离所附实施方案的精神或范围的情况下对其作出某些变化和修改。
[0216]
材料与一般方法重组dna技术dna操纵通过如sambrook j.等人，molecular cloning: a laboratory manual; cold spring harbor laboratory press, cold spring harbor, new york, 1989描述的标准技术进行。根据制造商说明使用分子生物学试剂。
[0217]
基因合成期望的基因区段由通过化学合成制成的寡核苷酸制备。两侧侧接单个限制性位点的300-4000 bp长的基因区段通过寡核苷酸的退火和连接(包括pcr扩增)进行组装，并且随后经指定的限制性位点进行克隆。通过dna测序确认亚克隆基因片段的dna序列。
[0218]
dna序列测定dna序列通过sanger测序确定。
[0219]
dna和蛋白序列分析和序列数据管理使用infomax的vector nti advance套件8.0版和snapgene viewer用于序列创建、映射、分析、注释和说明。
[0220]
实施例1. aav5衣壳变体文库的产生aav5衣壳变体文库通过cap基因序列的随机诱变产生(davidsson m.等人，2016)。简而言之，从头组装了血清5型cap基因的野生型序列(genbank id af085716.1)，之后使用尿嘧啶-dna糖基化酶将合成的野生型aav5衣壳基因片段化，使用不具有校对活性的dna聚合酶将所得片段组装成全长cap基因(作为结果，序列中出现随机突变)。将全长突变变体在与绿色荧光蛋白(gfp)的共同阅读框中于asci/ecori限制性位点处克隆到运载体质粒paav-接头(图1)内，从而产生一个多样化的aav5衣壳随机文库，之后使用该衣壳文库来选择具有增加的转导活性的衣壳变体。
[0221]
在体外对cho-k1-s细胞进行了转导活性增加的病毒粒子的阳性选择。因此，对于
转导，我们使用了在碘克沙醇梯度中使用超速离心纯化的粒子。48小时之后，收获细胞并分离基因组dna用于随后扩增能够有效转导的病毒基因组序列。之后，所得序列进行再克隆和再生产用于随后的选择迭代，以富集含具有最高转导效率的变体的文库。在5轮选择之后，对30个克隆的衣壳基因进行测序以确定最成功的突变及其组合。测序结果显示，主要突变组合为aav5 vp1中的s2a、t711s和aav5 vp1中含有s2a、t711s、s651a的衣壳变体，约占克隆的20%。还选择了在aav5 vp1中包含突变s651a的衣壳变体。这些衣壳变体被克隆到用于产生病毒粒子的载体内，并进一步被用于可视化和比较相对于野生型aav5的转导谱。
[0222]
实施例2. 从所得序列文库中产生并随后选择重组病毒粒子为产生重组病毒粒子并随后从所得序列文库中选择重组病毒粒子，开发了如下的一系列质粒：运载体质粒、包含rep基因序列的质粒以及包含病毒粒子复制所需的腺病毒基因的构建体。
[0223]
使用在hindiii/ecori位点处克隆的限制酶-连接酶方法，通过用从头合成的序列t2a-gfp取代来自cellbiolab (usa)的初始构建体paav-gfp对照质粒(vpk-402)中修饰的绿色荧光蛋白的序列，产生预期用于将aav血清5型的衣壳基因随机变体的文库克隆到一个带有报告蛋白的阅读框内的运载体质粒paav-接头(图1)，所述序列t2a-gfp含有来自5’末端的ecori限制性位点和来自3’末端的hindiii限制性位点的添加。
[0224]
包含rep基因序列的质粒paav-rep (图2)为通过以下来产生的：在pcii/psii限制性位点(new england biolabs, usa)处从头克隆aav血清2型rep基因(genbank id af043303.1)的合成的序列，随后用t4 dna聚合酶(new england biolabs, usa)进行处理，以在质粒pgem-t easy (promega, usa)内产生平头末端，所述质粒pgem-t easy也用pcii/psii限制酶(new england biolabs, usa)进行了处理。
[0225]
用于产生重组病毒粒子的腺病毒基因源于来自cellbiolab (usa)的商业试剂盒aav-2 packaging system (vpk-402)的构建体phelper (图3)，其包含：ampr，提供对于氨苄西林的抗性的β-内酰胺酶基因；ori，细菌中的复制起点；adeno e2a，参与病毒dna复制的辅助腺病毒基因序列；adeno e4，参与病毒dna复制的辅助腺病毒基因序列；adeno varna，负责翻译早期和晚期病毒基因两者的辅助腺病毒基因序列。
[0226]
实施例3. 用于产生基于改变的腺相关病毒血清5型(raav)的载体的方法为产生具有改变的血清5型衣壳的raav粒子，将生产细胞如下同时用3种质粒进行转染：1) 用包含编码组装raav粒子所需的蛋白和rna的腺病毒核苷酸序列的质粒(辅助质粒)进行转染；2) 用包含腺相关病毒血清2型的rep基因的天然核苷酸序列以及改变的cap基因的序列的质粒进行转染，所述改变的cap基因的序列选自seq id no: 5、6或7的核苷酸序列或编码具有seq id no: 2、3或4的氨基酸序列的vp1蛋白以及来自所使用的核苷酸序列的可选阅读框的vp2和vp3蛋白的任何其他核苷酸序列，其中vp2可具有seq id no: 8、9或10的任何氨基酸序列；和vp3可具有seq id no: 11、12或13的任何氨基酸序列；3) 用包含raav粒子的异源基因组的质粒进行转染，所述异源基因组编码预期用于递送至患者细胞内的靶基因。
(aav5-nullmut-gfp)相比较，所产生蛋白的量增加至4.6倍(从0.17 ng/ml到0.74 ng/ml)。
[0240]
当同时存在突变s2a和t711s两者(aav5-02mut-gfp)时，与具有野生型vp1衣壳蛋白的对照aav5 (aav5-nullmut-gfp)相比较，所产生蛋白的量增加至7.1倍(从0.17 ng/ml到1.24 ng/ml)。
[0241]
当同时存在突变s2a、s651a和t711s (aav5-03mut-gfp)时，与具有野生型vp1衣壳蛋白的对照aav5 (aav5-nullmut-gfp)相比较，所产生蛋白的量增加至3.3倍(从0.17 ng/ml到0.57 ng/ml)。
原文链接：https://www.xjishu.com/zhuanli/27/202080074154.html
